大肠杆菌内源性非编码RNA OxyS对秀丽线虫che-2基因表达与行为的...

来自 : cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD- 发布时间：2021-03-24

吴金晶 【摘要】：目的：研究大肠杆菌内源性非编码RNAOxyS对取食大肠杆菌的秀丽线虫化学感受基因che-2的表达和秀丽线虫行为的调控，以及这种调控作用的分子机理。 方法：通过秀丽线虫行为学实验分析大肠杆菌内源性非编码RNAOxyS对秀丽线虫行为的影响；逆转录PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)和实时定量PCR分别对秀丽线虫的化学感受基因che-2的mRNA表达进行半定量和定量的对比；通过蛋白质印迹（Western Blot）对秀丽线虫的CHE-2::GFP蛋白进行定量对比；使用共聚焦显微镜对秀丽线虫体内具有荧光标记的che-2基因时空表达进行成像研究。 1.食物竞争实验：OxyR和OxyS细菌上的野生型秀丽线虫N2的线虫数量随着时间逐渐减少，而ΔOxyS细菌上的线虫数量无明显变化。OxyS细菌上减少的线虫数量多于OxyR细菌。食物寻找能力实验：90min内95%的野生型N2能够找到食物OP50细菌，持续喂食OxyR或OxyS细菌一周后的野生型N2线虫能找到食物的线虫数量明显减少，分别为80%和75%，而且喂食OxyS细菌者比喂食OxyR细菌者更少。而只有大约10%的che-2突变型线虫能够找到食物OP50细菌。 2.氯化钠趋化实验：90min内95%的野生型N2能够到达氯化钠液滴，持续喂食OxyR或OxyS细菌一周后的野生型N2能够找到氯化钠液滴的线虫数量明显减少，分别为40%和25%，而且喂食OxyS细菌者比喂食OxyR者更少。只有大约10%的che-2突变型线虫能够找到氯化钠。醋酸钠化学躲避实验：90min内5%的野生型N2穿过醋酸铜线到培养盘的另一端，持续喂食OxyR或OxyS细菌一周后的野生型N2穿过醋酸铜线的数量明显增加，分别为20%和35%，而且喂食OxyS细菌者比喂食OxyR者更多。大约45%的che-2突变型线虫穿过醋酸铜线。 3.食物竞争实验：野生型N2在OxyS细菌上的线虫数量随着时间逐渐减少，但在OxyS-cb细菌上无明显变化。C. briggsae线虫在OxyS-cb细菌上的线虫数量随着时间逐渐减少，但在OxyS细菌上无明显变化。 4.食物竞争实验：野生型N2在OxyR细菌上的线虫数量随着时间逐渐减少，alg-2，sid-1，sid-2突变型线虫在OxyR细菌上的线虫数量也减少，dcr-1，rde-1，rde-2突变型线虫减少的程度相对较小，而alg-1，rde-4突变型线虫减少的程度最小。 5.食物竞争实验：野生型N2在OxyS细菌上的线虫数量会随着时间明显减少，而在che-2RNAi1细菌，che-2RNAi2细菌上的线虫数量减少的程度相对较小。食物寻找能力实验：90min内95%的野生型N2能够找到食物OP50细菌，喂食OxyS细菌、che-2RNAi1细菌或che-2RNAi2细菌一周后的野生型N2找到食物的线虫数量明显减少，分别为60%，75%，70%，而且喂食OxyS细菌者比喂食che-2RNAi细菌者更少。 6.共聚焦显微成像实验：持续喂食OxyR或OxyS细菌一周后的转基因线虫Pche-2::che-2::gfp的CHE-2::GFP荧光蛋白强度减弱。给予转基因线虫Pche-2::che-2::gfp注射体外转录合成的OxyS RNA后CHE-2::GFP荧光蛋白强度减弱。给予转基因线虫Pche-2::che-2::gfp注射17nt的单链小RNA后CHE-2::GFP荧光蛋白强度也减弱，但与注射OxyS RNA相比程度较小。蛋白质印迹表明以OxyR和OxyS细菌持续喂食转基因线虫Pche-2::che-2::gfp一周后其CHE-2::GFP蛋白含量水平降低。半定量逆转录PCR和实时定量PCR结果表明分别以OxyR和OxyS大肠杆菌持续喂食野生型N2一周后其che-2mRNA表达水平下降。 1.表达OxyS的大肠杆菌通过抑制秀丽线虫化学感受能力驱逐线虫，从而使其免于秀丽线虫的捕食产生自身保护作用。 2.大肠杆菌内源性非编码RNA OxyS在mRNA水平下调秀丽线虫化学感受基因che-2的表达。 3.非编码RNA OxyS可能可以产生物种间的进化作用，如捕食者（秀丽线虫）与被捕食者（大肠杆菌）间可能存在共同进化的关系，这将可能加深对生命科学研究的一个基本命题，即环境（包括食物）与动物基因表达的相互关系的认识。